تحضير معلق جراثيم الفطريات وقياس تراكيزها في الاعمال المختبريه

الدكتور حسام الدين عبدالله ومها رشيد توفيق
كلية الزراعة \ جامعة بغداد

تحضير معلق الجراثيم وتراكيزه

يعتبر تحضير معلق suspension الجراثيم لفطر ذو تركيز محدد concentration أو تحضير معلق وقياس تركيزه من العمليات المهمة التي يجب أن تتم بدقة , وأكثر المواد المستعملة في تحضير المعلق هو الماء المقطر المرشح المعقم , وغالبا تكوّن الجراثيم الساكنة

والجراثيم البلاستية والكونيديات غير الهوائية معلق جيد مع الماء دون صعوبة .

أما الكونيديات الهوائية لكثير من الفطريات الناقصة مثل فطر Beauveria bassiana وفطر Metarhizium anisopliae , و Nomuraea rileyi فهي كارهة للماء hydrophobic  لوجود طبقة متناهية الرقة على سطحها الخلوي تسمىRodlet layer درست في الميكروسكوب الالكتروني في فطرN.rileyi والتي تساعد في حمل وانتشار الكونيديات بالهواء وحمايتها ضد العوامل الفيزياوية , كما يعتقد أنها تلعب دور في تعلق الكونيديات على سطح كيوتكل العائل .

لذا يجب إضافة مادة لتحسين خلط وتوزيع الكونيديات بالماء وتحضير معلق متجانس وأفضل المواد استعمالا هي مادة Tween 80  وTween 20 بتركيز(0,1)% ( مل\لتر ماء ) .

على العكس من ذلك توجد بعض من الفطريات مثل بعض أنواع جنس Verticillium (Lecanicillium وفطر Tolypocladium تكون كونيديات هوائية لكنها تنشا في مجموعات لزجة فهي محبة للماء Hydrophilic وهي سريعة الانزلاق بالماء وتكون معلق شديد التوازن في الماء .

عند تحضير معلق من جراثيم كونيدية شديدة الجفاف يفضل إضافة الكمية المرغوبة من الجراثيم في أنبوبة اختبار فيها كمية قليلة من الماء المضاف إليه مادة أل Tween ثم يتم خلطها ببطء بواسطة عصا بلاستيكية أو زجاجية مستديرة الطرف مع إضافة كميات قليلة من الماء تدريجيا باستمرار التقليب حتى يتكون معلق سميك القوام ثم يضاف الماء ليصل لحجم 10 مل ثم تغلق الأنبوبة وترج جيدا للحصول على المعلق , وفيما يلي بعض الخطوات التي تسبق تحضير المعلق تبعا للهدف من استعماله :

1.   تحضير معلق من كونيديات حديثة Fresh  أو مخزنة للاختبارات الحيوية :  تستعمل الكونيديا الطازجة مباشرة في التحضير , أما الكونيديات المخزنة على درجات حرارة منخفضة فتترك تحت ظروف المختبر لمدة أربع ساعات على الأقل حتى تصل درجة حرارتها الى الدرجة السائدة في المختبر .

2.   تحضير معلق بهدف تحديد عدد الكونيديات في واحد غرام :  يوزن مقدار معين من الجراثيم ويفضل أن يكون 0,1 حجم ينقل إلى أنبوبة اختبار تحتوي 10 مل ماء مقطر فيحضر المعلق وتعد الكونيديات بطريقة الشريحة الزجاجية .

3.   تقديرعدد الكونيديات الناتجة على وحدة المساحة (واحد سم2) من بيئة صناعية : تؤخذ مساحة مقدارها 2 سم2 (1×2) سم من البيئة الزرعية كمكرر واحد على أن يتم القياس في خمسة مكررات على الأقل . تفصل مساحة اكبر قليلا من المساحة المطلوبة من الميديا بمشرط صغير معقم وتنقل بواسطة ملقط عريض الطرف على أوراق ملمترية وتستبعد المساحة الزائدة بقطع الزيادة بشكل رأسي ثم تنقل إلى أنبوبة اختبار فيها 5 مل ماء مقطر بوضع قطعة الميديا على فوهة الأنبوبة لتنزلق على جدارها إلى أسفل وتغلق الأنبوبة , وترج حتى تنفصل الكونيديات تدريجيا , ثم ينقل المعلق ببطء إلى أنبوبة أخرى دون جسم البيئة الزرعية ثم يضاف 5 مل أخرى من الماء المقطر المعقم إلى الأنبوبة الأولى وترج جيدا ثم ينقل الماء إلى الأنبوبة الثانية ببطء مع الدوران , وبذلك نحصل على كمية الكونيديات الموجودة على 2 سم2 في 10 مل ماء مقطر .  

4.   تحضير معلق من جراثيم موجود على جثة حشرة لاستخدامه كلقاح بيئة صناعية

تؤخذ الكونيديات من على قرني الاستشعار أو مفاصل الأرجل والرقبة بواسطة نيدل ويجب أن لا تلامس الإبرة جسم الحشرة أو السطح المتواجدة عليه أبدا . وتنقل الكونيديات إلى حجم صغير من الماء (2-5مللتر) تبعا لكمية الجراثيم المتاحة , ويفضل إضافة مضاد حيوي مع الماء ومادة أل Tween  .

5.   تحضير معلق من كونيديات (جراثيم) موجودة على جثة حشرة لمعاملة حشرات أخرى :

إذا كانت الحشرات صغيرة مثل المن وخنافس القلف والأطوار غير الكاملة للحشرات القشرية والذباب الأبيض فتضاف الحشرات إلى 3 مل على الأقل وبمعدل 5 حشرات لكل مللتر وترج جيدا وترشح من خلال طبقتين من الشاش Cheese cloth  .

أما إذا كانت الحشرات متوسطة الحجم مثل يرقات حفار ساق الذرة الأوروبي أو الحشرات البالغة لسوسة أوراق التين أو يرقات دودة ثمار التفاح نستخدم حشرة واحدة لكل مللتر ماء .

أما إذا كانت الحشرات كبيرة الحجم مثل يرقات دودة الشمع الكبدي أو سوسة النخيل الحمراء فتستخدم حشرة واحدة في 10 مللتر ماء ويمكن استخدام جزء من جثة الحشرة ويفضل الجزء الكامل لكثرة الكونيديات , وفي كل الحالات يتم الترشيح من خلال طبقتين من الشاش .  

قياس تراكيز جراثيم الفطر

يعتبر المعلق الذي يتم تحضيره معلق أساسي ذو تركيز مجهول Stock solution  وغالبا ما يتطلب قياس تركيزه , ونقصد بالتراكيز هو عدد الجراثيم الموجودة في مل واحد من المعلق (بوغ\مل) أو عدد الجراثيم الموجودة في لتر ماء (بوغ\لتر) وقد يعبر عن التركيز بالكثافة Density للجراثيم في المعلق . ويتم القياس بعد تحديد عدد الجراثيم Enumeration في عينة المعلق ,ويلزم لذلك تحضير سلسلة من التخفيفات Dilutions ولإجراء العمل بصورة صحيحة وتجنب التلوث يجب أن نهيأ ونجهز جميع الأدوات والمعدات المعقمة اللازمة لذلك . وتستخدم غالبا مجموعة من أنابيب الاختبار ذات أغطية أو تحضير أغطية مناسبة من الورق الشمعي Para film ومن ثم الأنابيب 1 , 2 , 3 , ……. الخ توضع بعد أنبوبة المعلق (س)من اليمين إلى اليسار على حامل الأنابيب , وتحضر مجموعة من الماصات المعقمة والمختلفة الأحجام بسعة 1, 2 , 5 , 10 مل بعد أن نخصص ماصة 10 مل للماء المقطر المعقم الحاوي على 0,1 % Tween ويجب أن لاتلامس أي من الأنابيب الأخرى .

والأفضل استخدام ماصة لكل تركيز ولسهولة العمل والحساب يؤخذ التخفيف من المعلق الأصلي (س) إلى الماء بنسبة 9:1 في الأنبوبة (1) ويتم التخفيف الثاني من الأنبوبة (1) إلى الأنبوبة (2) وهكذا .

يعني كل تخفيف أن الجراثيم التي كانت موجودة في مل من تركيز معين أصبحت موجودة في 10 مل من التركيز الثاني له ولذلك يكون معامل التخفيف الواحد 10 مل وعند الحساب يضرب عدد الجراثيم في 10 لكل تخفيف تم إجراءه .

ويتم قياس عدد الجراثيم في تخفيف تكون كثافة الجراثيم به منخفضة توجد عدة طرق للعد منها الطريقة المستخدمة في عد جراثيم الفطرBeauveria bassiana وفطر .M anisopliae تستخدم فيها شريحة ذات تدرج دقيق Micros ring لتقطير 5 مايكروليتر من معلق مائي مخفف على مركز شريحة زجاجية ونشرها على مساحة محددة وفحصها بالميكروسكوب وعد ما يقع منها في حقل الميكروسكوب , وهي من الطرق التي تحتاج إلى خبرة وتمرين كما انها تعطي تقدير لكثافة الجراثيم في المعلق .

أما أهم طريقة على مستوى المختبر فهي استعمال شريحة العد Hemocytometer  والتي تستخدم كطريقة لتقدير كثافة الجراثيم بالقياسات البصرية التي تستعمل على نطاق واسع في شركات إنتاج المستحضرات الحية .

شريحة العد Hemocytometer

أن استخدام شريحة العد للجراثيم تعتبر أفضل وأدق الطرق لتعيين التركيز على مستوى المختبر وذلك لسرعة وسهولة ودقة القياس والحساب فهي تستخدم لجميع أنواع جراثيم الفطريات الممرضة للحشرات لسهولتها ودقتها , وهي في الأصل مخصصة أصلا لتعيين عدد كريات الدم البيضاء في وحدة الحجم للإغراض الطبية .

وتوجد أنواع عديدة ولكن أفضلها وأكثرها انتشارا النوع الألماني Neubauer صنفت من قبل شركة Zeis تتميز بالبساطة ووضوح الخلايا والمربعات وعدم ازدواج الخطوط , مكتوب على يسار الشريحة كما موضح بالصورة (1) أبعاد وحدة القياس وهو مربع صغير RS (Reference squares ) مساحته 1\400ملم2 محفور بعمق مقداره 0,1 مللتر , يوجد في مركز الشريحة مساحتان متطابقتان للقياس (عليا وسفلى ) في وسط كل منهما 25 خلية (25 مربع كبير ) كل خلية فيها 16 مربع صغير Rs وعلى جانبيها مجريان عرضيان يقطعهما مجرى وسطي عرضي لتصبح هذه المجاري على هيئة حرف H ينساب من خلالها المعلق .

ومركز الشريحة عبارة عن منطقة مناسبة تماما لغطاء cover زجاجي خاص يوضع محكما على السطح بحيث إذا سكب المعلق من ماصة دقيقة ببطء في منتصف أعلى تلاقي الشريحة مع الغطاء ينساب ليملأ جميع الخلايا والمربعات .

           حجم المربع الصغير Rs 1\4000مللتر مكعب

       إذا مليء هذا المربع بمعلق الفطر وكان عدد الجراثيم 4 جراثيم يكون عدد الجراثيم

       في مل واحد (سم3) من المعلق :

        4×4000×1000= 16×10 6    

          توجد المربعات الصغيرة في خلايا كل خلية مكونة من 16 مربع صغير وأبعاد

      الخلية الواحدة  0,2 سم و 0,02 سم و 0,01 سم , فإذا تم ملأ الخلايا بالمعلق و

      كان عدد الجراثيم داخل الخلية الواحدة 64 يكون عدد الجراثيم في مل واحد من 

      المعلق (1 سم3) =

     14×1000000\4   =    64×0,01×0,02×0,2 

      108 ×16 = 16000000      

للاختصار إذا تم العدد في المربعات الصغيرة يضرب متوسط عدد الجراثيم في المربع الصغير في 4 × 106 وإذا تم العدد في المربعات الكبيرة يضرب متوسط عدد الجراثيم في الخلية الواحدة في 2,5 × 105   .

لقياس عدد الكونيديات في معلق تم تخفيفه مرتان متتاليتان كل منهما 9:1 مل (أي خفف 100 مرة) يتم وضع الشريحة على مسرح الميكروسكوب في الوسط ويوضع غطاء الشريحة في مكانه وتوضع نقطة رفيعة من المعلق عند منتصف الحد الأعلى لتلاصق الشريحة مع الغطاء ويرى بالعين المجردة سريان المعلق بين الشريحة والغطاء ويملأ الفراغ جميعه مع عدم تكون فقاعات هوائية ويضبط منتصف الشريحة تحت العدسة الشيئية 10 ويحرك مسرح الميكروسكوب حتى ترى خطوط التقاطع وتغير العدسة إلى القوة 40 وتضبط بالضابط الصغير حتى ترى الكونيديات داخل الخلايا وتترك الشريحة على الميكروسكوب دون إضاعة لمدة نصف دقيقة حتى تستقر الكونيديات تماما .

إذا تم العد في مستحلب زيتي تترك الشريحة لمدة ثلاثة دقائق , وفي كل الأحوال لايسمح بأن تغفل العين عن الشريحة .

تعد الكونيديات المتواجدة داخل المربع الصغير Rs وذلك في 16 مربع تتواجد داخل خلية واحدة , وغالبا يتم اختبار 5 خلايا عشوائيا , بحيث تكرار العد يتم بعدد الجراثيم الموجودة داخل أضلاع المربع والموجودة على الضلعين الأعلى والأيسر وتكتب الأرقام في صف واحد لكل خلية (16 مربع صغير مع فواصل بينها كالتالي ) :_ 

Call no.1= 2-4-1-6-5-0-1-3-20-4-1-1-4-3-1 = 38

Call no .2= 1-5-0-3-3-4-2-1-2-1-5-4-1-2-3-1 = 38

Call no .3= 0-3-2-3-1-4-3-4-1-1-0-0-1-2-2-4 = 31

Call no .4= 1-1-1-4-3-4-3-4-2-1-1-4-3-2-4-1-1 = 36

Call no .5=3-5-1-0-0-0-4-3-4-1-1-1-3-4-1-1-1-3 = 34

مجموع المربعات الخمسة الى 80 مربع صغير 38+38+31+36+34= 177 .

يحسب عدد الجراثيم في مل واحد من المعلق الأساسي :-

إذا استخدمنا عدد الجراثيم في المربعات الصغيرة بتقسيم ال177 على 80 حتى نحصل على متوسط عدد الكونيديات في المربع الواحد = 2,3 ×4×106 (معامل المللتر الواحد)×100 معامل التخفيف = 885000000 = 8,85×108 كونيديا للملل .

وإذا قمنا بعد الجراثيم في الخلايا = 177\5 ( للحصول على متوسط عدد الكونيديات في الخلية الواحدة ) ×2,5 × 105 (معامل الملل الواحد ) ×100 ( معامل التخفيف ) = 885000000 = 8,85 × 108 كونيديا \ مل .

بعد انتهاء العد تنظف الشريحة والغطاء بكحول ايثانول 70% ثم تجفف وتحفظ في المحفظة , وإذا جف المحلول على الشريحة لأي سبب تغسل بهيدروكسيد الصوديوم تركيز 1 % بعدها بالماء المقطر ثم كحول الإيثانول 70 % .

القياس والضبط

فيما يلي بعض الأمثلة لقياس تركيز المعلق أو ضبط التركيز :-

لتحضير معلق تركيزه 2×108 كونيديا \ مل :

يوزن حوالي 0,1 غم من الكونيديات ويحضر المعلق الأساس  stock solution (س) يخفف مرتين كل منهما 9:1 ثم تعد الكونيديات في عينة من التخفيف الأخير, إذا كان مجموع الكونيديات في 80 مربع هو 166 يكون العدد في مل واحد من المعلق الأساسي(س) = 166\80 ×4×106 ×100=8,3 ×108 التركيز المطلوب 2×108 لكل مل .

إذن تقسم 8,3× 108 على 2 ×108 =4,15 لذلك للحصول على التركيز المطلوب يضاف إلى كل مل من المعلق الأساسي 3,15 مل من الماء .  

مثال آخر لقياس عدد الكونيديات في غرام واحد من الفطر Beauveria bassiana  تجرى العملية التالية في خمسة مكررات على الأقل :-

يوزن 0,2 غم من الكونيديات تحضر بإضافة 20 مل ماء (س) تخفف مرتان كل منهما 9:1 نفرض أن متوسط عدد الكونيديات في المربع الواحد من المخفف الثاني 1,5 يكون عدد الجراثيم في مل واحد من المعلق (س) =  108 ×6=100× 106 ×4×1,5 ولأن الكونيديات التي وزنت كانت موجودة في 20 مل يكون عدد الكونيديات في 0,2 غم هو 6 × 108 ×20 = 1,2 × 1010

لذلك يكون عدد الجراثيم في الغرام الواحد =

1010 × 6 = 5 ×1010 × 1,2

لتحضير 15 مل من معلق (ص) تركيز 1 × 106 كونيديا \ مل من معلق (س) تركيز 1,5 × 108  كونيديا \مل :-

كل من معلق (س) المحتوي على 1,5 × 108 مطلوب أن يكون 1 × 106

أي أن 1,5 × 108  يقسم على 1 × 106  = 150 لذلك يضاف 0,1 مل من (س) إلى 14,9 مل ماء للحصول على 15 مل من (ص) .